一、液相色譜柱的基本結構。

  液相色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環）、篩板（濾片）、接頭、螺絲（封頭）與柱填料等組成。

柱管：多用不銹鋼制成，若果使用時柱壓不高于70 kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。用于柱填料的裝填。

壓帽：即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成，用于固定篩板。

密封環：位于接頭螺旋環內壁的彈性環，多為聚四氟乙烯制成，用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封。

    二、色譜柱使用前注意事項。

    色譜柱在使用前，hao進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是jia條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。

    1、樣品的前處理

    a、hao使用流動相溶解樣品。

    b、使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。

    c、使用0.45μm或0.22µm的過濾膜過濾除去微粒雜質。

    2、流動相的配制

    液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：

    a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。

    b、流動相與樣品不產生化學反應

    c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。

    d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，hao使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

    e、流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。     

    f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。

    3、流動相流速的選擇

    因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求jia柱效，hao使用jia流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。

    當選用jia流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。

    注意：

    a．含水流動相hao在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。hao加入die氮化鈉，防止細菌生長。

    b．流動相要求使用0.45 μm或0.22µm濾膜過濾，除去微粒雜質。

    c．使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

    三、 色譜柱的使用及維護

    1、C18等反相色譜柱使用維護

   色譜柱每次使用時一定不要直接使用含無機鹽的流動相！

A、建議首先使用含有10～30%乙腈或甲醇的高水相（不含鹽）沖洗系統及色譜柱30min以上（如用水-有機相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速沖洗30min以上），再更換為分析流動相。

B、如果流動相中含有緩沖鹽，請使用過渡流動相過渡后再換分析流動相平衡；

正確使用緩沖鹽，正確使用緩沖鹽的目的是防止緩沖鹽析出，使用緩沖鹽的方法可歸結為一句話：使用前要過渡，使用后要沖洗。具體方法如下：

• 等度條件：使用緩沖鹽前用過渡流動相以1.0mL/min 流速沖洗20-30倍柱體積，然后再使用含有緩沖鹽的流動相；使用后去除緩沖鹽的方法是用過渡流動相以1.0mL/min 流速沖洗30倍柱體積，然后以純有機溶液沖洗30倍柱體積保存。
• 梯度條件：用含有緩沖鹽的流動相進行梯度洗脫之前，用與初始流動相組成相同的過渡流動相以1.0mL/min 流速沖洗30倍柱體積，再開始梯度的運行；分析完成后，再用過渡流動相以1.0mL/min 沖洗色譜柱30倍柱體積，然后以純有機溶液沖洗30倍柱體積保存。

注意：過渡流動相是指有機相和水相比例與分析流動相相同比例，只是不含有緩

沖鹽；

阿奇霉素新柱：建議在正常平衡后增加0.1%磷酸/甲醇（90/10）沖洗17小時

C、注意事項。

C.1除 AQ外（可耐100%純水），其它反相柱應避免使用純水相，有機相比例建議在5%以上。即使AQ也應避免長時間使用100%水沖洗。如果一定要用100%水作為流動相，請在酸性條件下使用磷酸鹽緩沖液，這樣能延長色譜柱壽命。

C.2請注意色譜柱的pH、壓力耐受范圍，如超出范圍或變化幅度較大會引起重現性變差、色譜柱提前劣化等問題。

C.3在有機溶劑含量少、色譜柱溫度高的條件下，耐酸耐堿性能會降低。

C.4使用含有離子對試劑等表面活性劑的流動相，色譜柱的壽命會變短。

C.5請使用與分析柱相同填料的預柱，否則可能無法得到正常的色譜峰。

C.6.在使用了TFA等強有機酸或堿(pH>8)的流動相之后，請使用與所選用的流動相組成相同的有機溶劑和水的混合溶液進行置換。若是一周以上的長期保存，請進一步使用乙腈進行置換，并用附帶的堵頭密封，保存在冷暗處。

C.7通常的沖洗可使用高水相-高有機相-有機相（乙腈或甲醇）依次沖洗。在甲醇、乙腈沖洗過程中，重復注入100～200μl四qi呋喃或異丙醇可有助于去除強疏水性物質。

C.8當供試品溶液中含有一定量表面活性劑，多次進樣后，由于表面活性劑會在篩板及硅膠表面形成表面膜，導致峰變寬、拖尾甚至分叉。此時，處理方法如下：將色譜柱反向連接接(詢問廠家)，不接檢測器，用水-乙腈（90：10～95:5），以0.6ml/min流速沖洗2h以上→再用100%乙腈，以0.6ml/min流速沖洗1h以上→然后正向連接好色譜柱，用水-乙腈（90：10～95:5），以1ml/min流速沖洗1h以上→再用100%乙腈，以1ml/min流速沖洗1h以上

2、SCX 氫型陽離子交換柱。

A、每次使用時請一定避免直接使用含無機鹽的流動相，避免鹽析。可使用高水相過渡后再使用分析流動相。（葡jia胺樣品新柱子，用60%乙腈/40水過渡半小時（正常流速即可），后再直接用葡jia胺流動相平衡即可0.2ml流速平衡過液，沖洗也一樣先用60%乙腈40水，低流速沖半小時，后轉到100乙腈）

B、離子交換柱的平衡時間較反相柱更長，請在分析前保證充分的平衡。

C、.離子交換模式中，洗脫行為一般隨以下幾點發生大幅變化：

  ①pH ②鹽濃度 ③有機溶劑量 ④鹽種類

  *為了使樣品充分離子化，流動相pHhao與樣品的pKa相差 2.0以上

D、短期保存時，請使用含鹽的水系流動相來保存；長期保存時，請用出廠（或咨詢廠家）流動相純乙腈來保存。注意擰緊柱兩端自帶堵頭，防止溶劑揮發。

3、NH2色譜柱。

A、每次使用時請注意避免鹽析。

B、弱陰離子交換模式中，一般隨以下幾點洗脫行為發生大幅變化：

  ①pH ②鹽濃度 ③有機溶劑量 ④鹽種類

  *為了使樣品充分離子化，流動相pHhao與樣品的pKa相差 2.0以上

C、HILIC模式中，建議使用乙腈作為有機溶液。乙腈量增加，保留能力增大。

D、糖類的分析

 ①請設定乙腈/水的流動相條件。乙腈的濃度越高，則對糖的保留能力越強。

 ②若采用含甲醇或緩沖鹽的流動相，峰會展寬。

 ③將其他公司硅膠類NH2色譜柱流動相條件中的乙腈含量增加5vol%，使用我公司NH2柱可重現幾乎相同的色譜圖。

 ④若將糖的水溶液作為樣品注入，譜峰會展寬。請使用含乙腈50%以上的溶劑來配制糖類樣品。

 ⑤曾在酸性條件下使用過的色譜柱，糖類分析的保留時間、峰形會發生變化。

E、離子型物質的分析

 ①請設定乙腈/磷酸緩沖液且具有一定pH值的流動相條件。

 ②考察流動相條件時，按照pH由高到低的順序進行考察。如果曾經在低pH下使用，填料的表面將無法回到初始狀態。

 ③有時需要長時間平衡色譜柱(24小時以上)。平衡所需時間與通液量和鹽濃度緊密相關，因此，時間緊急時請提高流速，或pH不變而增加流動相的鹽濃度來進行平衡。

 ④抗壞血酸的色譜峰有時會出現拖尾現象(樣品氧化)。  

F、尿囊素的分析

 尿囊素在pH 2～8范圍內未離子化，請使用磷酸緩沖液作為流動相進行分析。

流動相例：25 mmol/L KH2PO4/ CH3CN = 20 / 80，pH=1.5(H3PO4)

G.一個月以內的保存，請使用與所選用流動相組成相同的有機溶劑和水的混合溶液（不含酸、無機鹽）進行置換，請避免只用水進行置換；一個月以上的長期保存，在進行了上述處理之后，請用出廠時的溶劑（乙腈）置換并保存 

四、 色譜柱的再生

    色譜柱經過一段時間的使用，會出現柱壓升高，柱效下降，一種可能是燒結濾片被堵塞；另一種可能是大分子進入柱內， 使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能是柱頭塌陷，死體積增大。您也可嘗試用下面列舉色譜柱再生的方法處理色譜柱。

A、反相色譜柱的再生：

用以下溶劑至少各30mL沖洗色譜柱(分析柱)

100%甲醇→100%乙腈→75%乙腈+25%異丙醇→100%異丙醇→100%二氯甲烷→100%己烷→100%異丙醇→75%乙腈+25% 異丙醇→100%乙腈

*若使用己烷或二氯甲烷沖洗色譜柱, 則在重新使用反相流動相以前, 必須用異丙醇沖洗色譜柱!!!

• 正相色譜柱的再生

一般情況下 ,極性固定相(如 Si , N H2 , Diol 基色譜填料) 的再生可以依次使用 20～30 倍色譜柱體積的正已烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇沖洗色譜柱(因異丙醇的粘度較大 ,沖洗過程中隨時注意調整沖洗流速) ,然后再以相反的溶劑順序沖洗色譜柱。